我是王立铭。2024年10月6日，第六十八期《巡山报告》又和你见面了。

在本期报告中，我们讨论最近刚刚发布的一项新研究：利用一种常见的寄生虫，突破血脑屏障，将各种蛋白质药物投送到患者大脑中[1]。

血脑屏障与药物开发的难题

想要说明这项研究的意义，我首先得介绍一下血脑屏障（Blood-brain barrier）这个概念，让你了解一下它的特殊性。我们知道，人体的所有器官、组织和细胞都无法独立生存，需要持续不断的氧气和养料供应，以及持续不断地清除代谢废物和毒物。在人体中，这个任务一般来说是由密布全身的血管系统承担的。人体的血管总长度达到了惊人的10万公里，密布全身的末梢毛细血管触达和支持了人体中除了毛发、眼角膜、牙齿之外的所有器官、组织和细胞，为它们运输氧气和养料，并带走代谢废物[2]。也就是说，人体中大部分的新陈代谢都是通过末梢毛细血管来完成的。

但大脑却是一个显著的例外。作为人体中最为精密复杂的器官，大脑的工作要求极高，它需要极其稳定的化学环境。因此，人体需要严格控制脑能接触到什么样的物质，更需要把各种可能致病的微生物和脑隔绝开来，而完成这项艰巨使命的，就是血脑屏障。我们来比较一下血脑屏障与一般血管系统的差异：具体来说，在微观尺度下，正常的末梢毛细血管，结构是比较松散的，血管壁上到处都是缝隙，血管内外的物质可以自由进出和交换，这也是血管能供应养料和收集废物的基础。但在脑中，毛细血管可以从内到外分成这么几层，构成了我们所说的血脑屏障：首先，构成血管壁的内皮细胞彼此之间形成了紧密连接；其次，血管壁外还围绕了一层薄而柔韧的基底膜；最后，在基底膜之外，大脑中的胶质细胞还会再加一层包裹。这三层结构有效地阻止了血管内的物质渗漏[3]。由此可见，血脑屏障跟一般的毛细血管末梢之间有着巨大的差异。

从概念上说，你可以这么理解血脑屏障：它像是一层薄薄的透明气泡，把整个大脑包裹起来，毛细血管只能停留在这层膜之外。只有极少数物质，例如氧气分子和脂肪分子，能被动扩散、自由穿越这层膜。其他需要进出大脑的物质，包括细胞必须的养料例如葡萄糖、氨基酸等等，都必须通过这层膜上的特殊“关卡”蛋白，被这些关卡识别并主动搬运到脑内。这样一来，大脑就能在一个相对纯净和稳定的环境中工作。

很显然，血脑屏障的作用是非常重要的，一旦被破坏，就可能导致各种疾病。例如一种很常见的神经系统疾病叫多发性硬化症（multiple sclerosis）。它的发病原因就是血脑屏障出现破损，伴随血液循环全身的免疫细胞能够进入大脑，攻击大脑神经元表面的特殊物质，影响患者的感官、运动、心智等等能力[4]。

但祸福相依的是，严密的血脑屏障其实也为脑疾病的药物开发制造了巨大障碍。人类开发的各种药物，如果想要进入大脑治疗脑中的疾病，也同样需要穿越血脑屏障——而这，却是一件非常困难的任务。

对于小分子化学药物来说，尚且有一些常规技术思路能部分解决这个问题（尽管仍旧非常繁琐和困难），例如增加分子的脂溶性、降低分子量、减少表面的负电荷等等，让小分子药物能模仿脂肪分子，被动扩散，穿过血脑屏障进入脑中。但对于生物大分子药物，例如蛋白质药物、抗体药物，乃至细胞基因治疗药物等，它们的体积庞大，无法被动扩散穿越血脑屏障，同时显然又不会被血脑屏障上的关卡蛋白主动识别和运输。因此，这些大分子药物想要进入大脑并治疗疾病就成了一个难题[5]。

寄生虫：突破血脑屏障的奇招

在过去不少年，医药开发者们不断地尝试各种思路，试图将大分子药物有效投送到大脑中。这里我简单展示几个有趣的思路。

一个重要的方向，是利用转铁蛋白受体（transferrin receptor）。这个受体分子的作用是结合细胞外的转铁蛋白（transferrin），将携带铁离子的转铁蛋白运送到细胞内，从而帮助细胞获取吸收铁离子。举例来说，红细胞需要铁离子来制造血红蛋白、用于运输氧气，所以红细胞表面就有大量的转铁蛋白受体，帮助它们吸收铁离子。而构成血脑屏障的血管内皮细胞，也同样有大量的转铁蛋白受体。因此，一个药物开发思路就是，在蛋白质药物上，增加一个能结合转铁蛋白受体的功能模块（例如转铁蛋白的片段，或者转铁蛋白受体的抗体），让药物能够借用铁离子运输的路径穿越血脑屏障，进入大脑[6]。例如，罗氏制药正在开发中的一款药物Trontinemab就是如此。它是一个双特异性抗体药物，一头结合并清除脑中的异常Abeta蛋白，用于治疗阿尔茨海默症；另一头则结合转铁蛋白受体并借此穿越血脑屏障，从而大大提高了药物在脑中的浓度[7]。除此之外，另一个值得一提的药物开发思路，是使用诸如病毒载体或者纳米颗粒载体的方式，将编码蛋白质药物的DNA/RNA直接投送到脑中，再通过转录和翻译过程生产蛋白质药物。例如，可以将转铁蛋白片段嵌入空心的脂质体纳米颗粒（LNP, lipid nanoparticle）表面[8]，或者直接筛选能够穿越血脑屏障的腺相关病毒载体(AAV, adeno-associated virus)[9]，这些尝试都有不错的研究进展。

以上两个突破血脑屏障的做法，无论是增加功能模块，还是先投送再转录翻译，都是较为常规的思路。但这期报告我们要介绍的，是一个听起来有点惊世骇俗的思路：利用一种能够进入脑中的寄生虫，来递送大分子药物。

让我们先来介绍一下这种神奇的寄生虫，这种寄生虫就是大名鼎鼎的弓形虫（Toxoplasma gondii）。它是一种微小的细胞内寄生虫，身体呈香蕉形或新月形，长3.5～6.5μm，宽1.5～3.5μm，一端尖，另一端钝圆。很多喜欢养猫的人对它不会陌生，因为弓形虫目前唯一已知的最终宿主就是猫，弓形虫只能在猫体内进行有性繁殖。不过，虽然它偏爱呆在猫的身上，但也不代表其它生物就绝对安全。实际上，弓形虫可以在包括人类在内的多种脊椎动物体内生存，对他们造成一定破坏。甚至还有研究发现，如果孕期女性感染了弓形虫，可能会引起胎儿的畸形乃至死亡。这也是为什么很多文章都建议准妈妈们，要提前筛查自家猫咪的弓形虫感染问题[10]。

而弓形虫最神奇也最值得关注的一点则是，它在感染动物后能够进入其大脑，寄生于神经细胞内，甚至改变动物的行为。而且，这很可能正是弓形虫赖以生存的“计谋”。有研究发现，如果弓形虫感染了小鼠并进入小鼠大脑，能够让小鼠从恐惧猫变成愿意靠近猫[11]。这种变化对小鼠自然是种灾难，但却帮助了弓形虫的生存和繁殖——当无畏的小鼠被猫捕食，弓形虫就能顺水推舟地进入猫的体内，并完成其繁殖后代的使命。

可想而知，在生存压力的长期选择下，弓形虫有着非常强大的突破血脑屏障进入大脑的能力。还不光如此，作为一种细胞内寄生虫，弓形虫在跨越血脑屏障之后，还能进入神经元内部，并且分泌一些特殊蛋白质到神经元中，以帮助自身的生存。

这自然就提示了一个非常有趣的问题：我们能否利用弓形虫突破血脑屏障的原理，将大分子药物投送进入大脑、甚至是大脑神经元的内部呢？

这的确是个很有创意的思路，但和刚刚咱们讨论过的几个技术路线不同，这里面还有太多人类未知的问题。比如，弓形虫到底是如何跨越血脑屏障进入大脑的，又是如何进入神经元并分泌特定蛋白质的。人们对它们的认知至今都并不清晰，借用起来自然难度就比较大。

如何利用寄生虫给药物“搭便车”

这期我想给大家介绍的，是一个更加直接便捷的思路：那就是直接对弓形虫进行基因改造，把活的弓形虫作为药物载体，再把需要递送的蛋白质药物直接连接在弓形虫内部，搭便车进入脑中。

让我们来介绍一下这个“便车”是怎么搭上的。具体而言，研究者们找到了两个弓形虫的特定基因，一个名叫toxofilin，一个叫GRA16。之所以选择这两个基因，是因为他们对应的蛋白质在弓形虫细胞内有特殊的定位，toxofilin是一个叫做棒状体（rhoptry）的细胞结构的一部分，GRA16则位于一个叫做致密颗粒（dense granule）的细胞结构上。棒状体和致密颗粒都是弓形虫的蛋白质分泌系统，但具体作用略有差别：当弓形虫游离于宿主细胞外时，能利用棒状体将特定蛋白质依次“注射”进入不同的宿主细胞[12]；当弓形虫进入宿主细胞内时，能利用致密颗粒将特定蛋白质“释放”到宿主细胞内部[13]。具体的实验操作过程中，研究者们把需要递送的蛋白质药物所对应的DNA片段，连接在弓形虫基因组编码toxofilin或者GRA16的位置上。这样一来，在弓形虫自身生产toxofilin和GRA16蛋白的时候，也会顺便制造出药物蛋白质分子，所谓的“搭便车”便完成了。最后，弓形虫就能携带这些药物分子穿越血脑屏障进入神经细胞内部，再将这些药物分子释放出来，起到治疗作用。

当然，这只是一个理论上的推测，具体结果如何呢？

我们需要大量的实验，来验证蛋白质药物在实际操作过程中，究竟能不能完成预想的“搭便车”。研究者们首先尝试了不同的潜在蛋白质药物，例如和脊髓肌肉萎缩症有关的SMN1蛋白、和克拉伯病相关的GALC蛋白、和帕金森氏症相关的PARK2蛋白、和自闭症相关的MECP2蛋白、和溶酶体贮积症相关的TFEB蛋白等等。他们发现，如果将这些蛋白质分子对应的基因序列接入弓形虫基因组中，再利用弓形虫感染体外培养细胞，至少其中几个蛋白确实能够被弓形虫有效地携带和分泌进入细胞内部，例如SMN1、 TFEB、 MECP2等。

基因改造弓形虫初步取得成功，接下来更重要的当然是验证在动物模型中，弓形虫是否确实可以携带药物跨越血脑屏障，并且把药物释放到大脑的神经细胞内，乃至改善疾病症状。为了验证这个过程，研究者们选取了MECP2这个蛋白。

这里稍微再介绍一下MECP2。它是神经系统发育过程中的一个重要蛋白质，能够结合基因组DNA上的特定位置，抑制基因转录活动。如果MECP2基因存在天然缺陷，人会患上Rett综合征，这是一种严重影响儿童精神运动发育的疾病，是广义的自闭症谱系的一个细分类别，发病率为1/10000～1/15000，主要发生在女孩身上[14]。患者在婴儿期就会开始出现症状，逐步丧失语言和行动能力，表现出运动失常、癫痫、呼吸系统障碍、自闭症状、手部刻板行为等。考虑到Rett综合征和MECP2基因缺陷之间的明确关联，将MECP2基因重新放回神经元中，是一个很自然的Rett综合征治疗思路[15]。

因此，研究者们将编码MECP2蛋白的DNA片段连接在了弓形虫GRA16基因末端，然后测试了这些基因改造过后的弓形虫活性。结果发现，在体外培养的神经细胞中，以及在体外培养的大脑类器官中，这种弓形虫都能有效地将MECP2蛋白释放到神经细胞内，并展示出一定程度的生物化学活性，例如能结合DNA特定位置，改变基因转录活动等等。如果将这种弓形虫注射进入小鼠腹腔，研究者们也能在小鼠的大脑中观察到弓形虫的存在，以及MECP2蛋白在神经细胞内的释放。这说明弓形虫确实能携带MECP2蛋白突破血脑屏障进入小鼠脑中，并分泌进入小鼠神经细胞内。

当然这里我们也需要注意，尽管研究者们已展示出弓形虫在携带MECP2蛋白质方面的潜力，但这项研究至今仍然面临着许多挑战。目前，研究者们还并未真正测试在缺失MECP2基因、出现自闭症行为表现的小鼠模型中，利用弓形虫递送MECP2蛋白质是否能够有效改善疾病症状，而这显然是更为关键的验证指标。在此背景下，研究者们也意识到，需要更深入地探讨该系统的实际效果及其应用潜力。根据论文中呈现的数据，目前利用弓形虫递送MECP2蛋白的效率还比较低，这体现在进入大脑的弓形虫只能感染较低比例的神经元，也体现在被释放进入神经元内部的MECP2蛋白质浓度也比较低，可能还不足以起到明显的治疗作用。

显然，如果真要利用弓形虫系统向脑内递送药物分子，人们大概率还需要对这个系统进行深度的改造和优化，提高其递送效率。当然这本身并不奇怪，脑内药物递送本来就是挑战性极大的技术，人们对弓形虫自身的行为也缺乏足够深入地理解。对此，研究者们也在论文中提出了一系列未来的研究思路，例如需要提高弓形虫的使用量，多次注射弓形虫载体，筛选突破血脑屏障能力更强的弓形虫，使用toxofilin和GRA16之外的位点用于递送蛋白质药物，修改基因序列以提高递送效率……还有，在前面的讨论中我们也提到，研究者们尝试了大量的潜在药物蛋白，但只有几个能够被弓形虫有效的生产和分泌，为什么不是所有的蛋白质药物都能利用这个系统成功进入细胞，研究者们没有做详细的分析。这可能还是因为人们对弓形虫在宿主细胞内的行为，特别是分泌蛋白的具体机制仍然不是完全清楚。想要把弓形虫真正变成威力巨大、而且具有普适性的的药物递送平台，人们还有很多工作要做。

不过，任何革命性的技术都不可避免地需要类似的持续优化和改善，弓形虫自然也不例外。但考虑到弓形虫突破血脑屏障、感染神经细胞、向神经细胞分泌蛋白质的能力，是经过长期进化锤炼获得的，我们有理由相信这套系统确实有独特的价值和巨大的想象空间。一个具体的例子是，在这项研究中，研究者们还发现这套系统能用来携带诸如cas9这样的基因编辑工具跨越血脑屏障进入神经细胞内，定向修改目标基因序列，起到基因治疗的作用；也能投送cre重组酶这样的基因开关进入神经细胞内，在特定时间和条件下打开和关闭某个基因的表达。这说明，弓形虫这套药物递送系统，还有巨大的通用性潜力。

好了，这就是本期巡山报告的全部内容。

我是王立铭，下个月6号，我继续为你巡山。

参考资料

[1]https://www.nature.com/articles/s41564-024-01750-6
[2]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4292164/
[3]https://fluidsbarrierscns.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12987-020-00230-3
[4]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25431839/
[5]https://www.nature.com/articles/s41573-021-00139-y
[6]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31376426/
[7]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10572082/
[8]https://www.mdpi.com/1999-4923/14/2/279
[9]https://www.science.org/doi/10.1126/science.adm8386
[10]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9862191/
[11]https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0023277
[12]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18059289/
[13]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34043960/
[14]https://www.nature.com/articles/ng1099_185
[15]https://www.frontiersin.org/journals/genetics/articles/10.3389/fgene.2021.620859/full