王立铭·巡山报告｜第五十二期：亨廷顿舞蹈症迎来突破？

源济

第五十二期：亨廷顿舞蹈症迎来突破？

你好，我是王立铭。2023年6月6日，第52期《巡山报告》又和你见面了。

这一期《巡山报告》的主题是一种著名的罕见遗传疾病——亨廷顿舞蹈症（Huntington's Disease）。这个领域近年来进展不断。借着这次《巡山报告》，我们详细说说人类对抗这种疾病的当前状况和未来前景。

亨廷顿舞蹈症的病理

亨廷顿舞蹈症在全球范围内的发病率大约在十万分之一到万分之一之间。之所以被叫作“亨廷顿舞蹈症”，是因为美国医生乔治·亨廷顿在1872年首先对这一类病患进行了详细的追踪和记录 [1]。

亨廷顿医生当时注意到，在某些家族中，代代都有人患上一种特殊的疾病，往往表现为，在30-50岁之间，出现记忆和认知功能衰退、抑郁、妄想等精神问题，当然，更突出的表现是运动机能下降。患者的眼球、面部和肢体不自觉地震颤、抖动和摇晃，甚至发展到全身无规律地摆动，就像不由自主地舞蹈那样。患者往往在出现症状后10-15年内死亡。

20世纪80-90年代，研究者们认识到，亨廷顿舞蹈症是一种常染色体显性遗传病，基因变异出现在4号染色体一个名为Huntington的基因内部 [2][3]。

这个简称Htt的基因，对于动物和人类的正常发育是必须的，对大脑神经细胞的正常活动也有贡献，但具体作用方式还不十分清楚。

在Htt基因内部，存在一连串的由CAG三个碱基形成的重复序列。制造蛋白质的时候，CAG三联碱基对应的是一个特定的氨基酸——谷氨酰胺，简称Q。在大多数健康人当中，CAG的重复次数，或者说氨基酸Q的重复次数，在几个到二三十个之间。

如果Q的重复次数超过40，Htt蛋白质的分子结构和功能就会受到剧烈干扰——它们会在神经细胞内彼此交联、聚集，破坏细胞的正常功能，最终导致神经细胞死亡和大脑功能障碍。也有研究发现，Q的重复数量越大，患者发病时间越早，疾病症状也越严重。

很显然，如果父母携带了含有超量CAG重复序列的Htt基因，也就是mHtt（mutant Htt），就有可能把这种基因变异传递给子女，从而让疾病在家族内代代相传。

听到这里，我们很容易联想到，亨廷顿舞蹈症的发病机理和更为常见的神经退行性疾病，比如阿尔茨海默病、帕金森氏症有相似之处。后两者的发病过程也包括异常蛋白质分子的出现和聚集 [4]。

而和病因更加复杂难解的后两种疾病相比，亨廷顿舞蹈症的病因非常单纯和专一，就是Htt基因内部CAG碱基重复数量的增加。因此很多人认为，在征服神经退行性疾病的道路上，亨廷顿舞蹈症会是率先被攻克的那一个“低垂的果实”。

但事与愿违的是，至今还没有诞生任何一个能从根本上延缓、逆转和预防亨廷顿舞蹈症发病的方法。

在临床实践中，医生们只能根据亨廷顿舞蹈症患者的具体症状来对症治疗。比如，用抗抑郁药缓解患者的情绪问题；用安眠药对抗失眠问题；如果患者出现肌肉痉挛导致的吞咽困难，则需要在胃部造痿、直接送入食物等。

相比之下，倒是在更为复杂的阿尔茨海默病和帕金森氏症中，多种有效的药物和医疗器械被陆续发明出来，比如2023年刚刚获批的阿尔茨海默病药物Leqembi [5]。

常规治疗方法

究竟要如何彻底解决亨廷顿舞蹈症的问题呢？

从逻辑上说，既然我们已经知道这种疾病的直接病因，就是含有太多氨基酸Q重复的mHtt蛋白，或者说含有太多CAG重复的mHtt基因，那么如果能在患者大脑中降低这种蛋白的产量，或者降低这个基因的活动，应该就能起作用。

最直接的思路是设计药物，降解和破坏mHtt蛋白。

这一点实现起来并不容易。因为传统小分子药物，要么是结合一个酶分子的活性部位，阻止这个酶分子工作，要么是结合蛋白质分子的某个接触界面，阻止它和其他蛋白质结合。问题是，Htt蛋白本身是不是有酶活性、有什么样的酶活性、和什么蛋白质的结合对疾病最为关键，本身都还是没有搞清楚的问题，因此无法有的放矢地设计小分子药物。

过去几年，研究者们开发了几种全新类型的小分子药物来实现这个目的。这些小分子药物的工作原理大致是这样的：它们可以一头结合Htt蛋白，另一头结合能导致蛋白降解的泛素连接酶或自噬小体，从而把致病蛋白质拖入细胞内的废物处理厂，破碎处理掉 [6][7]。

这类思路广义上都属于近年来大红大紫的蛋白质降解药物（protein degraders），确实被寄予厚望。不过，这个思路虽然已经被证明能有效降解mHtt，但目前还没有进入真正的临床试验阶段。

另一个与之相辅相成的思路是，降解生产mHtt蛋白的信使RNA，也就是mRNA。

我们都知道生物学的中心法则：DNA携带遗传信息，根据自身序列制造mRNA，而mRNA则根据自身序列制造蛋白质。因此，如果把mHtt基因对应的mRNA分子破坏掉，也能阻止致病Htt蛋白的生产。

比如，美国Ionis公司开发的反义寡核苷酸药物Tominersen，能和mHtt基因的mRNA分子配对结合，导致后者被降解 [8][9]。遗憾的是，在2021年，这款药物的三期临床试验被叫停，原因可能是在亨廷顿舞蹈症患者中并没有看到疾病症状的改善 [10]。

当然，这条技术路线并没有被宣判死刑。

2022年，Tominersen的开发者又启动了一项全新的临床研究，试图在年龄和症状都比较轻的患者中再次尝试 [11]。另一家采用类似技术路线的公司Wave Life Sciences，也在临床研究中积极推进它们的产品 [12]。

基因疗法

如果把上面两种思路看成是扬汤止沸——在mHtt蛋白出现后，再想办法破坏它，那么基因疗法则有可能起到釜底抽薪的作用——直接修改mHtt基因，破坏它制造蛋白质的能力，或者干脆把它内部的CAG重复数量降低到健康人的水平。

直接修改mHtt基因、破坏它制造致病蛋白的能力，这个在技术上较为容易实现。

过去十年来，以CRISPR/cas9技术为代表的基因编辑技术在定点破坏基因序列上展示了惊人的实力 [13]。

在特定向导RNA（gRNA, guide RNA）的引导下，cas9蛋白质可以被定位到生物基因组DNA的特定位置，并且切断DNA双链。DNA双链被切断后，就会启动修复程序。因为细胞内并没有默认正确的序列可供参照，于是DNA双链在愈合修复的过程中往往会随机增加或者丢失几个碱基。这种随机改变大概率会破坏一个基因编码蛋白质的功能。

举例来说，2021年，Intellia公司首次进行了体内基因编辑的临床试验，它就是利用CRISPR/cas9技术，定点破坏患者体内出现基因变异的转甲状腺素基因，治疗由这种基因变异导致的罕见遗传病 [14]。

基于类似的逻辑，2017年，研究者们也在亨廷顿舞蹈症的小鼠模型上做了类似尝试。

这种小鼠的Htt基因内部被人为插入了一段140个CAG的重复序列，用于模拟严重的亨廷顿舞蹈症患者。这些小鼠也确实出现了明显的mHtt蛋白表达、mHtt蛋白大规模聚集，以及运动机能障碍。

试验中，研究人员用改造过的腺相关病毒AAV作为载体，将CRISPR/cas9系统投送到小鼠脑中，在140个CAG重复序列的两侧各切一刀，制造两个DNA断口。

结果就发现，两端的DNA断口重新愈合之后，不仅会丢掉中间的140个CAG重复，往往还会顺带破坏整个mHtt基因的功能。研究者也确实证明，这个办法不光能有效去除mHtt蛋白，还能显著改善小鼠的运动能力 [15]。

但这个研究一个明显的遗憾是，亨廷顿舞蹈症的小鼠模型固然在遗传学上和人类患者相似，也出现了运动机能障碍，但和人类患者还是有一个相当根本的区别——这些小鼠的大脑神经细胞并不会死亡。换句话说，亨廷顿舞蹈症小鼠模型展示的可能是由大量mHtt蛋白堆积导致的神经毒性疾病，而不是人类那样的由大量神经细胞死亡导致的神经退行性疾病。

为了解决这个问题，同时也为了在体型更接近人类的动物中模拟亨廷顿舞蹈症，研究者在2018年开发出了亨廷顿舞蹈症的猪模型。

猪模型的构建方法和小鼠模型类似，也是在Htt基因中插入一段150个CAG的重复序列。但和小鼠模型不同的是，这些转基因猪除了呈现出mHtt蛋白的累积和聚集、行为能力和整体健康的衰退之外，还表现出明显的和人类患者接近的神经退行症状——不同脑区中，都观察到了神经细胞的死亡和大脑结构的变化 [16]。

显然，不管是研究亨廷顿舞蹈症的致病机理，还是测试亨廷顿舞蹈症的候选药物，这种猪模型都比小鼠模型更有价值。

2023年初，同一群研究者又进一步把上面两项研究进行了综合，试图在亨廷顿舞蹈症猪模型中验证基因编辑是否可以治疗疾病 [17]。

基本的试验设计是这样的：

我们已知，如果猪的Htt基因内部携带150个CAG重复序列，这些猪就会表现出类似人类亨廷顿舞蹈症的神经退行性症状。于是在这些猪的脑内，研究者们注射了两个AAV病毒载体，一个装载cas9蛋白，另一个装载和小鼠实验中一样的向导RNA序列，分别指向CAG重复序列的两端。

两个病毒载体进入大脑后，能将负责切割DNA的cas9和负责定位的向导RNA导入同一细胞。这样一来，在这些细胞内部，CRISPR/cas9系统就能制造两个断口，将多余的CAG重复序列切除，并且在mHtt基因内部制造微小的随机变异，从而彻底破坏mHtt基因的异常功能。

除了上面这些常规设计之外，研究者们这一次还增加了一个新的技术变量——在投送基因编辑工具的同时，还把一段正常的、仅含有20个CAG重复的Htt基因序列投送到了猪的大脑中。

为什么这么做呢？

这是因为，在CRISPR/cas9工具切断DNA后，新出现的DNA断口有两种常见的修复模式：

一种模式就是刚刚我们描述的比较粗糙和随机的模式，学名叫作“非同源末端连接”（NHEJ, non-homologous end joining）。大致可以理解成，两个DNA断口被强行拼接在一起，因为细胞也不知道正确拼法是什么，所以会出现各种随机的错误，从而破坏基因的功能。

另一种模式是，如果断口附近恰好存在一段和断裂的DNA序列高度一致的DNA片段，细胞就会倾向于选择以这段DNA为模板，把断口位置修复得和模板完全一致。这种模式学名叫作“同源重组修复”（HDR, homology directed repair）。

基于这个原因，把一段含有20个CAG重复的正常Htt基因序列投送到细胞内，CRISPR/cas9工具在Htt基因内部制造两个断口后，就会产生两个可能的结果：一个是，细胞利用这段含有20个CAG重复的序列进行修复，把mHtt基因替换成正常Htt基因；另一个则是，细胞忽略这段同源序列的存在，继续进行非同源末端连接，直接破坏mHtt基因的功能。

从治疗疾病的角度看，两者可能没有本质的区别。因为不管是把mHtt基因修复成正常的样子，还是干脆破坏mHtt基因的功能，都能减少细胞内的mHtt蛋白，消除亨廷顿舞蹈症的直接病因，改善疾病的症状。

而且必须要说明的是，同样是修复DNA断口，同源重组修复的效率远低于非同源末端连接。这倒不奇怪，毕竟前者多出了一个寻找修复模板进行替换的过程。

具体到这项研究中，研究者也发现，那些成功实现了基因编辑的细胞，大约只有15-20%的完成了同源重组修复，获得了正常的Htt基因；其余的仍然是非同源末端连接，mHtt基因被彻底破坏了。

但即便如此，这种修复仍然是值得探索的技术方案。

首先，尽管人们已经知道，Htt基因在成年动物体内并不重要，即便缺失也不影响正常生活，但我们很难说它一点功能都没有。因此，对于一个出了问题的mHtt基因，能够把它修复成正常的样子，总比不分青红皂白就把它彻底破坏了好。

其次，就算亨廷顿舞蹈症的治疗不需要这么精致，也还有很多人类疾病，特别是遗传疾病，背后是某个基因特定位置的变异和某个基因具体功能的变化，需要的是精确修复，而不是粗暴破坏。

举例来说，由Pde6b基因变异导致的视网膜色素变性患者，需要的治疗方案就是对Pde6b基因的序列进行精确修复。在这个时候，摸索如何实现更精确的同源重组修复，同时进一步提高修复效率，就是非常重要的 [18]。

因此，这项在亨廷顿舞蹈症猪模型中进行的探索，也能帮助我们进一步理解，在大型动物体内进行精确基因修复的可行性、难度和未来优化方向。

同时值得提出的是，研究者还尝试了在新生小猪中利用静脉注射，而不是脑内注射的方法，实现基因编辑和修复，同样证明了治疗的有效性。

这说明，起码在新生儿阶段，静脉注射已经足以保证基因编辑工具顺利进入大脑，并编辑足够数量的细胞，展现持久的治疗效果。这当然是个好消息。在脑内注射AAV病毒尽管已经是常规技术，但毕竟涉及到颅骨打洞、颅内注射等一系列手术操作，患者的接受度和术后感染的风险不容乐观。如果能直接静脉注射治疗脑内疾病，对医生和患者都是很好的消息。

在世界范围内，基因治疗，包括多种全新基因编辑工具的应用，正在成为生物医药市场新的热点。期待针对人体致病基因开展的治疗，能像曾经的重组蛋白药物、单克隆抗体药物、RNA疫苗、小核酸药物那样改变很多疾病的治疗模式，制造新的产业机会。

近年来，有多款基于AAV病毒载体的基因治疗产品获批上市（如治疗脊髓性肌萎缩症的药物Zolgensma，治疗遗传性视网膜营养不良的药物 Luxturna，治疗芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症的Upstaza）。

也许久攻不克的神经退行性疾病，包括亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病和帕金森氏症等，也能从基因治疗的进步中获得新的解决思路。

好。这就是本月的《巡山报告》。下个月6号，我继续为你巡山。

参考资料

[1] Bhattacharyya K. B. (2016). The story of George Huntington and his disease. Annals of Indian Academy of Neurology, 19(1), 25–28.
[2] Gusella, J. F., Wexler, N. S., Conneally, P. M., Naylor, S. L., Anderson, M. A., Tanzi, R. E., Watkins, P. C., Ottina, K., Wallace, M. R., & Sakaguchi, A. Y. (1983). A polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington's disease. Nature, 306(5940), 234–238.
[3] A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. (1993). Cell, 72(6), 971–983.
[4] Ross, C. A., & Poirier, M. A. (2004). Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine, 10 Suppl(7), S10–S17.
[5] FDA. (2023). FDA Grants Accelerated Approval for Alzheimer's Disease Treatment. https://www.fda.gov/news-events/ ... s-disease-treatment
[6] Tomoshige, S., Nomura, S., Ohgane, K., Hashimoto, Y., & Ishikawa, M. (2017). Discovery of Small Molecules that Induce the Degradation of Huntingtin. Angewandte Chemie (International ed. in English), 56(38), 11530–11533.
[7] Li, Z., Wang, C., Wang, Z., Zhu, C., Li, J., Sha, T., Ma, L., Gao, C., Yang, Y., Sun, Y., Wang, J., Sun, X., Lu, C., Difiglia, M., Mei, Y., Ding, C., Luo, S., Dang, Y., Ding, Y., Fei, Y., … Lu, B. (2019). Allele-selective lowering of mutant HTT protein by HTT-LC3 linker compounds. Nature, 575(7781), 203–209.
[8] Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., Wancewicz, E. V., Mazur, C., McAlonis, M. M., Pytel, K. A., Artates, J. W., Weiss, A., Cheng, S. H., Shihabuddin, L. S., Hung, G., Bennett, C. F., & Cleveland, D. W. (2012). Sustained therapeutic reversal of Huntington's disease by transient repression of huntingtin synthesis. Neuron, 74(6), 1031–1044.
[9] Ionis Pharmaceuticals. (2018). IONIS-HTT Rx (RG6042) Top-Line Data Demonstrate Significant Reductions of Disease-Causing Mutant Huntingtin Protein in People with Huntington's Disease. https://ir.ionispharma.com/node/23401/pdf
[10] Kingwell K. (2021). Double setback for ASO trials in Huntington disease. Nature reviews. Drug discovery, 20(6), 412–413.
[11] Ionis Pharmaceuticals. (2022). Ionis' partner to evaluate tominersen for Huntington's disease in new Phase 2 trial. https://ir.ionispharma.com/news- ... s-disease-new-phase
[12] Wave Life Sciences. (2022). Wave Life Sciences Announces Positive Update from Phase 1b/2a SELECT-HD Trial with Initial Results Indicating Allele-Selective Target Engagement with WVE-003 in Huntington's Disease. https://ir.wavelifesciences.com/ ... e-phase-1b2a-select
[13] Fathema Uddin, Charles M. Rudin, Charles M. Rudin, Triparna Sen, & Triparna Sen. (2020). CRISPR Gene Therapy: Applications, Limitations, and Implications for the Future. Frontiers in Oncology, 10.
[14] Gillmore, J. D., Gane, E., Taubel, J., Kao, J., Fontana, M., Maitland, M. L., Seitzer, J., O’Connell, D., Walsh, K. R., Wood, K., Phillips, J., Xu, Y., Amaral, A., Boyd, A. P., Cehelsky, J. E., McKee, M. D., Schiermeier, A., Harari, O., Murphy, A., … Lebwohl, D. (2021). CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. The New England Journal of Medicine, 385(6), 493–502.
[15] Yang, S., Chang, R., Yang, H., Zhao, T., Hong, Y., Kong, H. E., Sun, X., Qin, Z., Jin, P., Li, S., & Li, X. J. (2017). CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington's disease. The Journal of clinical investigation, 127(7), 2719–2724.
[16] Yan, S., Tu, Z., Liu, Z., Fan, N., Yang, H., Yang, S., Yang, W., Zhao, Y., Ouyang, Z., Lai, C., Yang, H., Li, L., Liu, Q., Shi, H., Xu, G., Zhao, H., Wei, H., Pei, Z., Li, S., Lai, L., … Li, X. J. (2018). A Huntingtin Knockin Pig Model Recapitulates Features of Selective Neurodegeneration in Huntington's Disease. Cell, 173(4), 989–1002.e13.
[17] Yan, S., Zheng, X., Lin, Y., Li, C., Liu, Z., Li, J., Tu, Z., Zhao, Y., Huang, C., Chen, Y., Li, J., Song, X., Han, B., Wang, W., Liang, W., Lai, L., Li, X.-J., & Li, S. (2023). Cas9-mediated replacement of expanded CAG repeats in a pig model of Huntington’s disease. Nature Biomedical Engineering.
[18] Cai, Y., Cheng, T., Yao, Y., Li, X., Ma, Y., Li, L., Zhao, H., Bao, J., Zhang, M., Qiu, Z., & Xue, T. (2019). In vivo genome editing rescues photoreceptor degeneration via a Cas9/RecA-mediated homology-directed repair pathway. Science Advances, 5(4).