“智识前沿学者”、浙江大学教授王立铭
在暌违了一个月之后，《生命科学·巡山报告》改版后重新与知识分子的读者见面。在这一期，“智识前沿学者”、浙江大学教授王立铭补上发表于4月份的两项值得介绍的科研新进展——新一代人体多能干细胞制备技术和细菌促进乳腺癌转移的发现。
两项研究都来自国内学者，其中人体化学诱导多能干细胞（human chemical-induced pluripotent stem cells，hCiPS细胞）相比细胞遗传改造具有明显的优势，目前眼球病变、糖尿病治疗领域拥有应用前景；细菌促进乳腺癌转移的发现则是在肠道菌群大热背景下的一项意外发现，展现了生物体内部复杂和精巧的生存技能。
撰文 | 王立铭
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你好，我是王立铭。2022年6月6日，第39期《巡山报告》又重新和你见面了。
在2022年4月的生命科学领域，有这么2个问题，我认为你值得关注。
新一代人体多能干细胞制备技术
首先要为你介绍的是一种全新的制备人体多能干细胞的技术，它可能代表着干细胞和再生医学领域一次革命性的进展。这项研究是北京大学邓宏魁教授实验室完成的，相关的研究发表在2022年4月13日《自然》杂志 [1]。
想要说清楚这项技术的意义，我们得先从什么叫多能干细胞（pluripotent stem cell）说起。多能干细胞指的是动物体内一类特殊的干细胞：这种细胞通过持续的分裂和分化，能够形成完整动物体所需的所有类型的身体细胞。以人体为例，在自然条件下，这种细胞只会出现在一个极其特殊的时间段，就是从精子卵子结合形成受精卵后几天到十几天当中，在这个时间窗口里，每个微小的人类胚胎中含有大约几百个多能干细胞，它们将会在接下来38周左右的时间里持续分裂和分化，形成组成完整人体的超过200种细胞类型，从皮肤、毛发、到肌肉、神经等。
打个比方来说，多能干细胞的分化过程，有点像一块巨石从山顶滚落的过程。位于山顶的巨石拥有很多条潜在的下滑路径，恰如多能干细胞具备大量的分化潜能。随着巨石的滚落，路径选择会逐步收窄，这恰如随着多能干细胞的持续分裂，会诞生不再有分化潜能、却拥有确定生物学功能的不同细胞类型。
这类具备完整分化潜能的干细胞，承载了人类再生医学的全部理想。人体的衰老和各种疾病的发生，其实都可以看成是某些身体细胞失去活力、丧失正常功能，却又得不到替换的结果。
人们很早就畅想过，如果能够收集个体自身的多能干细胞，再把它们定向分化成为不同的细胞、组织和器官，人类就可以随心所欲地替换身体中出现衰老和病变的部位，人类战胜疾病、衰老甚至是死亡似乎就不再是纯粹的想象了。
当然，这个想法长久以来就只能是个幻想。因为对每个具体的人而言，多能干细胞早就在胚胎发育的极早期消失了。有科学家尝试采集试管婴儿过程中废弃的一部分人类胚胎，提取当中的多能干细胞，但这些细胞的来源显然不稳定，细胞数量也很少，做做研究固然可以，想要用于支撑再生医学的应用那就差得太多了。
除此之外，唯一被证明可行的方案是1960年代英国科学家 John Gurdon 发明的细胞核移植技术。John Gurdon 用很细的针管把动物身体细胞的细胞核吸出来，注射到已经去除了细胞核的卵细胞当中，发现卵细胞提供的化学环境可以恢复身体细胞核的分化潜能。著名的克隆羊“多利”就是如此制造出来的 [2]。但显然，这个方法也不适合大规模应用，首先人体卵细胞的来源和伦理约束就是一个很大的障碍。
这个局面一直到2006-2007年才发生了革命性的改变。2006年，日本科学家山中伸弥和他的博士后高桥和利合作发表了一篇划时代的论文，证明在成年小鼠的身体细胞（成纤维细胞）中引入四个转录因子基因的表达，就足以逆转这些身体细胞的分化过程，把它们重新变回多能干细胞状态，具备重新分化成不同类型身体细胞的能力，恰如将已经坠落至地面的巨石重新推上山顶。这就是著名的所谓人工诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS细胞）的概念 [3]。
这四个能够逆转细胞命运的基因也被称为 “山中因子”，分别是Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。到了2007年，中山实验室和美国威斯康星大学麦迪逊分校的James Thomson实验室又分别证明类似技术也可以将人体细胞重新诱导为iPS细胞状态 [4-5]。
在那之后，全世界不少实验室都在尝试将这些iPS细胞定向分化为不同类型的细胞，比如皮肤细胞、肌肉细胞、神经细胞等；甚至是不同的器官和组织，比如分泌胰岛素的胰岛、能够规律收缩的心肌、肝脏类器官等等。
研究者们也开始尝试利用这些iPS细胞治疗疾病。比如2019年，美国批准了一项临床试验，试图用这项技术治疗老年黄斑变性（AMD, age-related macular degeneration）。具体而言，研究者们会从患者体内抽取血液细胞，将它们改造诱导成多能干细胞，定向分化成为视网膜色素细胞，再通过手术植入到患者的眼球中，以保护患者脆弱的视网膜感光细胞，挽救他们的视力 [6]。当然，需要强调一下，截至2022年5月，iPS细胞还没有被正式批准上市用来治疗任何一种疾病。
请注意，这项技术从诞生起就一直伴随这一个巨大的隐患：如何保证iPS细胞的安全性和可控性？为了人工诱导出多能干细胞状态，人们需要对细胞进行遗传改造。比如上文提到的 “山中因子”，就需要用病毒作为载体，把四个不同的基因片段引入细胞内并强制其持续活跃和生产蛋白质，从而起到逆转细胞命运的效果。这样一来，这些经过遗传改造的细胞就天然带有一些安全隐患。比如，这些基因片段如果插入人体基因组DNA序列当中，会不会破坏正常的人体基因，让细胞出现意想不到的异常？再比如，如果这几个基因持续长时间地活跃，会不会让这些细胞的分裂繁殖失去控制，甚至有致癌风险？
基于这些问题，研究者们在不断测试和验证iPS细胞的分化潜能和临床价值的同时，也在不断地改进诱导技术，试图找到更安全、更可控的iPS细胞生产技术路线。
在这些方法里，最值得一提的，也是今天我们要介绍的方法，是用小分子化学物质替代遗传改造，直接逆转细胞的分化过程，制造iPS细胞。
早在2008年，哈佛大学 Douglas Melton 实验室率先证明，如果在用四个 “山中因子” 诱导iPS细胞的时候加入丙戊酸（valproic acid, VPA），能够将诱导效率提高100倍，甚至可以完全替代四个 “山中因子” 中潜在致癌风险最大的那个因子——c-Myc。
同样在2008年，美国Scripps研究所的丁胜实验室证明，可以用小分子化学物质同时替代两个 “山中因子”（Sox2和c-Myc）的作用。2010年，丁胜实验室和北京大学邓宏魁实验室进一步缩小了遗传改造的力度，他们证明只需要引入一个 “山中因子” ——Oct4，结合小分子化学物质的刺激，就可以诱导产生iPS细胞。到了2013年，邓宏魁实验室更是一举实现了对山中因子遗传操作的完全替代，通过7个小分子化学物质的组合（简称VC6TFZN），直接将小鼠成纤维细胞诱导进入iPS状态，而且效率可以和山中四因子的遗传操作相当 [7]。
用小分子化学物质诱导iPS细胞的优势是显而易见的。化学分子进入细胞后，能够结合和干扰某些特定蛋白质分子的功能，起到模拟遗传操作的作用。但化学分子的浓度可以人工精细调节，诱导完成后还可以通过更换培养液的方式快速清除，显然比直接往细胞里转几个基因的操作要更安全和可控，而且更容易进行标准化的大量生产。
但从2013年至今，人们一直没有攻克最后的难题：用化学物质可以诱导产生小鼠iPS细胞，但用化学物质诱导人体iPS细胞却始终没有成功。对此，研究者们一个普遍的猜测是，相比小鼠细胞，人体细胞的命运决定过程更加 “稳定” 和 “顽固”，很难被化学物质轻易地改变。继续沿用那个巨石的比方，对人体细胞来说，巨石滚落的路径更为陡峭、崎岖和漫长，因此一旦下坠之后想要重新推上山顶就非常困难了。
直到2022年4月13日，邓宏魁实验室发表的这项工作，才第一次实现了将人体细胞重新诱导成为多能干细胞的过程。这是一个需要二十几种化学物质组合，耗时长达1个半月到2个月的繁琐过程。
简单总结来说，2013年之后，邓宏魁实验室的研究者们对小鼠化学诱导干细胞的过程进行了更详细的分析。他们逐渐意识到，尽管7个化学物质是一次性添加的，但细胞的状态却并非直接一步从身体细胞变成多能干细胞，而是经历了几个逐渐接近早期胚胎细胞的中间状态 [8]。基于这个发现，他们的计划是，面对状态更顽固、更难以被转化的人体细胞，需要更精细的分阶段逐步提高这些细胞的分化潜能，最终实现把巨石推回山顶的目标。
最终，他们找到了这样一套方案：首先用6个化学物质的组合将人体成纤维细胞诱导进入一种类似上皮细胞的状态，这个过程耗时8-10天；然后再添加3种化学物质，将细胞诱导进入一种去分化状态——也就是说这个阶段细胞失去了特定的类型标记，处于一种身份未定的中间态，耗时16-20天；然后，再经过9种化学物质和5种化学物质的两步处理，将这种去分化状态的细胞真正改造成为具备无穷分化潜能的人体多能干细胞。
这就是我们所说难题中的hCiPS细胞：人体化学诱导多能干细胞（human chemical-induced pluripotent stem cells）。
研究者们随后用了一系列方法验证hCiPS细胞确实是人们期待已久的人体多能干细胞。他们证明了这些细胞的形态、基因表达特征、染色体结构特征都符合人体胚胎中的多能干细胞。而且这些细胞也能够被诱导成为各种细胞类型，如血液细胞、肝脏细胞和神经细胞等。
同样很有启发的是，研究者们还对整条诱导路径上不同状态的细胞做了详细的分析。他们利用单细胞测序技术分析了不同诱导阶段下细胞基因表达的差异，完整再现了人体细胞被诱导到多能干细胞状态过程中发生的变化。
他们认为，在整个路径上最关键的步骤是刚提到的第二步——将细胞诱导进入一种身份未定的中间状态。在这个阶段，细胞还不具备分化潜能，但许多和早期胚胎发育相关的基因被开启，DNA整体的甲基化修饰水平降低，染色体也整体处于更加松散的状态，这都接近了早期胚胎干细胞、而不是高度分化的身体细胞特征。看起来对人体细胞来说，已经坠地的巨石无法一鼓作气的推上山顶，但研究者们找到了半山腰一处开阔的平台，在这里稍作休息之后再继续推动，成功率就高多了。
这是一项激动人心的成就，北京大学的研究者们在十几年的持续努力和改进之后，终于找到了一条完全不依赖细胞核移植，也不需要遗传操作，纯粹使用小分子化学物质制造人体多能干细胞的技术。更让人高兴的是，这项技术是中国科学家领导完成的，是中国科学界对全球干细胞研究领域和再生医学领域的重要贡献。
展望未来，这项技术的应用前景自然是非常广阔的。既然我们能用小分子化学物质安全和高效地将人体细胞重新诱导进入干细胞状态，那么我们就可以针对不同细胞类型、不同疾病领域，探索如何使用这些干细胞进行组织和器官的再生和替代。
我们刚刚提到的眼球病变是一个热点，因为在眼球中开展治疗相对比较方便。另一个目前在业界非常火热的方向是人工诱导胰岛细胞，移植之后治疗糖尿病。此前人们已经在尝试使用胚胎干细胞或者遗传操作产生的iPS细胞去生成胰岛，相关的人体临床试验也已经在进行中。化学诱导的多能干细胞也已经被用于这个方向 [9]。
未来，化学诱导的多能干细胞（hCiPS细胞）能否在人体试验中进一步明确其更优秀的安全性和生产方面的优势，能否用于更多人类疾病的治疗，则是我们非常期待并会持续关注的话题。
细菌促进乳腺癌的转移
我要为你介绍的第二项研究，来自西湖大学蔡尚研究员团队，相关研究发表在2022年4月14日的《细胞》杂志 [10]。这项研究试图说明这样一个问题：细菌在乳腺癌转移过程中起到了什么作用？
乳腺癌、细菌，这两个概念似乎从根子上就联系不到一起去。我们知道乳腺癌是全球女性最常见的癌症类型。近年来全球每年都有超过200万人患上乳腺癌，中国的患病人数占比约1/5 [11]。这种疾病主要是由女性乳房中的乳腺导管细胞或者小叶细胞发生基因变异、细胞不受控制的大量繁殖所引起的。而人体中当然也有大量的细菌，据估算总数量有几十万亿个，甚至可能还超过了人体细胞的总数量。但绝大多数细菌都寄生在皮肤、口腔、肠道当中——所以有时候人们甚至会把人体的寄生细菌直接叫做 “肠道菌群”。这些肠道细菌对人体的健康确实有不少影响，比如食物的消化吸收、特定营养物质的合成（如维生素K）、人体免疫机能，甚至还有大脑发育和精神疾病方面的影响。也确实有证据表明肠道菌群的异常和肠癌的风险和预后有关 [12]。但要说它们和距离甚远的乳腺癌有关，还是太玄乎了一点。
但在2020年前后，几个实验室先后发现在肠道之外，比如肺癌、乳腺癌等等，肿瘤组织内部也能找到某些细菌的存在 [13-14]。但在这些组织内部，细菌的数量过于稀少，检测难度很大，也一直有人怀疑这些发现其实是实验过程被污染的结果。肿瘤组织内部为什么会出现细菌也更是让人一头雾水——一个自然的猜想是肿瘤的发生就是这些细菌的入侵引起的，但也完全有可能是肿瘤组织的异常生长给了细菌寄生的机会，或者仅仅是巧合而已。
蔡尚实验室的这项工作就是针对这一系列问题展开的。他们使用了一种能够自发出现乳腺癌的转基因小鼠（MMTV-PyMT模型），然后开发了非常灵敏的检测手段，用基因测序和细菌培养的方法证明，这些小鼠乳腺肿瘤组织里的细菌含量确实比正常乳腺组织提升了接近10倍。当然即便如此，细菌的含量——大约1克肿瘤组织有一万多个细菌——还是非常低的，要知道1克肿瘤组织里人体细胞的数量都有上百万个了。加上肿瘤组织里的细菌本身也都是人体比较常见的细菌类别，比如肠球菌、葡萄球菌、乳杆菌、链球菌等。也因此之前存在不少模糊和争议地带。
更进一步的，研究者们还用灵敏的光学成像技术直接看到了乳腺癌组织里稀疏分布的细菌。一个惊人的发现是：绝大多数（97.25%）肿瘤组织里的细菌都位于肿瘤细胞内部——用能够穿透细胞膜的抗生素（比如多西环素），能够有效地杀死这些细菌；反过来那些无法穿透细胞膜的抗生素就无能为力了。
肿瘤治疗目前最大的难点，其实并不是器官病变后第一次出现的肿瘤（所谓原位肿瘤），而是肿瘤神出鬼没的转移和扩散。后者指的是在原位肿瘤在持续地生长和变异之后，部分肿瘤细胞脱离原位肿瘤，顺着人体循环系统迁移到身体其他部位，在那里重新落地生根长出来的肿瘤。
原位肿瘤往往可以通过手术、放疗、化疗等手段有效地移除；而一旦转移，转移时间、转移部位，往往难以预测和控制。
在被研究的这种小鼠模型中，晚期乳腺癌往往会引起肺部的转移——这也是晚期乳腺癌患者最容易出现的转移部位。既然乳腺癌细胞内部生长着一些特殊的细菌，那么研究者们自然就推测，如果这些乳腺癌细胞迁移扩散了，是不是也会带着这些细菌一并迁移？
答案是确定的。研究者们在乳腺癌组织里注射带有荧光标记的细菌，在肺部转移的肿瘤中发现了这些细菌，甚至还在血液里流动的肿瘤碎片里也找到了细菌的存在。
原位的乳腺癌细胞里、血液里的肿瘤碎片里、转移到肺部的肿瘤细胞里，都找到了细菌。那接下来很自然的问题是，这些细菌的存在到底有什么用？
一个同样自然的验证方法是生物学里常用的 “功能缺失实验”——看看杀死这些细菌之后，小鼠的乳腺癌会不会有什么不同。但是我们刚刚也提到过了，动物体内绝大多数的细菌都寄生在肠道当中，如果用抗生素无差别的杀死细菌，可能首先破坏的是肠道菌群的正常功能。
最后研究者们找到了一个更精准的方法：他们发现如果口服多种抗生素的混合（万古霉素、新霉素、亚胺培南/西司他丁、两性霉素B），会杀死肠道菌群但不影响肿瘤细菌；如果静脉注射则作用相反，只杀死肿瘤细菌但不影响肠道菌群。这样一来，两种操作方式还提供了一个合适的对比。结果发现：混合抗生素杀死肿瘤组织内部的细菌之后，乳腺肿瘤的出现和生长并未受到影响，但乳腺肿瘤的转移却被大大抑制了！
那是不是说明这些细菌确实促进了乳腺癌的转移呢？为了进一步验证这个猜测，光 “功能缺失实验” 可能还不够，还需要所谓的 “功能增强实验”——如果肿瘤细胞被人为感染了细菌，是不是就更容易转移了。
研究者们的这项实验设计也很有意思。他们先提取了一部分肿瘤细胞在实验室里培养，然后人为感染了上面讲到的细菌，再把这些肿瘤重新注射到小鼠乳腺里，发现果然大大提高了肺部转移的概率。刚刚讲到，静脉注射抗生素能够有效地杀死乳腺癌里的细菌，降低肿瘤转移的机会，而在这些经过杀菌的小鼠身体里，如果重新再注射一些细菌，那么肿瘤转移的能力又重新被唤醒了。
通过 “功能缺失实验” 和 “功能增强实验” 的可逆结果，细菌和肿瘤转移的因果关系才算是得到了严格的证明。
证明之后的新问题是，这个因果关系本身又是如何产生呢？也就是说，为啥被细菌寄生了，肿瘤细胞就更容易转移了？细菌又是如何赋予肿瘤细胞这种超长能力的呢？
研究者们也没有特别明确的头绪，实验方法也很简单——通过单细胞测序的方法，看了看这些被细菌入侵的肿瘤细胞里哪些基因的活动发生了变化？结果发现感受机械压力的基因活动被大大提高了，支撑细胞结构的所谓 “细胞骨架” 也发生了显著变化。
这是一个很有启发性的发现。细菌入侵需要穿透细胞膜，这个过程影响细胞的原有结构、刺激到细胞的压力感受器本身并不奇怪，但这件事却阴差阳错地模拟了肿瘤迁移的环境。
在肿瘤扩散转移的过程中，从原位肿瘤脱落的肿瘤细胞或者肿瘤碎片需要进入血液循环，直至找到新的栖息地。但血液对它们却是一个非常危险的环境，除了免疫细胞的识别杀伤，血液的压力本身也会杀死大部分转移中的肿瘤细胞。看起来，细菌的入侵使得癌细胞对血压做了提前适应，这当然会大大提高癌症扩散转移的成功率。
在研究的最后，研究者们又在人体肿瘤样本中做了验证，看看在小鼠模型中的发现是否真有临床价值，结果也确实发现了两者之间的高度相似性。
比如，人体乳腺癌组织里的细菌含量也显著高于正常组织，其中主要的细菌类型也包括肠球菌和链球菌，转移部位的癌组织和原发乳腺癌组织中的细菌类型也很相近，等等。
当然，可以想象，想要在人类患者中完成全部的数据验证是很困难的，也有医学伦理的挑战。但研究者们的这些对比至少提示我们，在人类乳腺癌的转移过程中，细菌入侵也许也起到了推波助澜的作用。
如何评价这项研究的意义呢？我觉得至少有这么几个维度。
首先，从基础研究的角度看，这是科研人员首次证明了肿瘤细胞内部的细菌和癌症发病之间的因果关系：细菌入侵不影响肿瘤的生长，但增加了肿瘤的转移能力。这个发现是否能够推广到更多的肿瘤类型中，推广到人类患者当中，肯定已经是不少癌症研究同行的共同关注点。说的更广泛一点，正常人体细胞内部看起来也同样有含量及其稀少的细菌，这些细菌有没有什么功能和影响，是否涉及到其他类型的人类疾病，可能都是值得关注的科学问题。
其次，从临床应用的角度看，研究者们也证明了注射特定抗生素能够有效地杀死肿瘤细胞内细菌，并且显著抑制肿瘤的转移。这个思路是否可以用来开发预防肿瘤转移的药物和疗法，是否对包括乳腺癌在内的多种癌症有价值，也肯定会是值得追踪的医学探索方向。
最后还有一点特别值得讨论一下：
从逻辑上说，对癌细胞来说，被细菌入侵和定居大概不是什么好事，毕竟这些寄生者会抢夺有限的资源，可能还会损害癌细胞的“健康”和生存。但恰恰也是这些寄生者的存在，在一定程度上模拟了肿瘤细胞迁移的过程，帮助这些肿瘤细胞提前准备好了应对血液压力的挑战。这个过程本身就可以看成是生物进化过程的绝妙证明。细菌和癌细胞实现了某种程度的互惠互利，帮助了彼此的生存 [15]。
顺着这个逻辑推演出一系列问题：是不是一些肿瘤细胞更容易吸引细菌入侵？被细菌入侵的细胞是否更容易从原位肿瘤上脱落、更容易在新的转移部位存活？肿瘤细胞是否会主动帮助细菌在自己内部的寄生和繁殖？这些细菌是否会利用肿瘤细胞的什么特性在细胞之间扩散？
这些问题可能都值得我们思考和研究。这些问题也在提醒我们，在亿万年进化之后，生物体内部发展出了多么复杂和精巧的生存技能！
这就是本期巡山的全部内容，下个月6号，我们不见不散。 
参考文献：（上下滑动可浏览）
[1]https://www.nature.com/articles/s41586-022-04593-5
[2]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8598906/
[3]https://www.cell.com/fulltext/S0092-8674(06)00976-7
[4](https://www.cell.com/fulltext/S0092-8674(07)01471-7
[5]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18029452/)
[6]https://www.nih.gov/news-events/news-releases/nih-launches-first-us-clinical-trial-patient-derived-stem-cell-therapy-replace-dying-cells-retina
[7]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23868920/
[8]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29937202/
[9]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35115708/
[10]https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867422002604
[11] https://pcm.amegroups.com/article/view/6573/html
[12]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32101723/
[13]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30712876/
[14]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32467386/
[15]https://www.nature.com/articles/s41579-022-00738-5
狗仔卡
发表于 2022-6-5 10:51 PM
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