全新分子工具箱，揭开大脑更深的奥秘 |《自然》技术特写

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全新分子工具箱，揭开大脑更深的奥秘 |《自然》技术特写

Original Nature Portfolio Nature Portfolio  2022-02-21 22:40

原文作者：Esther Landhuis

科学家们正在用各种方式，越来越精准地实时探测神经元的活动、功能和组构。

生命中神经反应无处不在：听到声响时回头、发令枪响后腿部肌肉的紧张，以及受过训练的口渴小鼠循特定音调奔向水流。

BARseq2技术可以检测到信使RNA片段（彩色），并帮助研究人员看到这些片段是在大脑的哪一层。来源：Yu-Chi Sun et al./Nature Neurosci.

这种奖励相关行为背后的机制很难弄清。神经细胞通常可以蜿蜒穿过多个脑区，其长长的轴突和密集的树突可以点亮成千上万的相邻细胞对话。神经丝异常精细，它们的位置也很关键：扰乱神经网络可能会导致一系列神经系统疾病。美国艾伦脑科学研究所（Allen Institute for Brain Science）的神经科学家Xiaoyin Chen说：“如果你想同时多标记几个神经元，并追踪它们的轴突走向，这真的很难做到。”

尽管如此，研究者们正在想方设法解决这一难题，他们利用测序、光遗传（optogenetics）以及蛋白质工程等技术来追踪神经元连接、记录它们的活动、测量其输入和输出并绘制神经元网络图。

传统方法是用荧光染料标记细胞，然后置于显微镜下观察。但这种技术通常只能跟踪少数细胞。为此，纽约冷泉港实验室（Cold Spring Harbor Laboratory）的Anthony Zador和他的同事们研发了一种工具，可以并行追踪成千上万个神经元。他们没有使用染料，而是用病毒在每个神经元中插入一个独特的RNA序列——条形码（barcode）。然后，他们可以从病毒注射位点附近区域取样，研磨后提取RNA，然后对其测序以寻找条形码，从而绘制出神经元之间的通路。

这种被称为MAPseq（基于测序技术的多路分析）的技术发表于2016年[1]。Xiaoyin Chen说它被公认为绘制高通量神经元连接图的一项技术突破。但它只能大致指出轴突的走向，就像只知道县一级的地址但无法具体到街道。Xiaoyin Chen最近作为博士后研究员加入了Zador的实验室，他希望能得到更多细节。比如说，MAPseq能显示他所研究的神经元在听觉皮层，但却无法指明它具体处在听觉皮层六层中的哪一层。

于是，Chen对这个技术做了一个重大修改。他并没有从碾碎的脑切片中测序条形码，而是直接原位测序，从而保留了其空间位置信息。“现在你不仅仍能得到同样的神经投射模式，而且可以看到这些细胞在哪里。”Chen说。

这种技术称为BARseq（基于测序的条码解剖学）[2]，它帮助研究人员将神经投射模式和特定基因表达等属性联系了起来。Chen及其同事结合了BARseq、荧光原位杂交（FISH）以及靶向蛋白标记（targeted protein labelling）技术，来标定不同种类的神经元。

神经元成像的改进

2021年上半年，Chen和他的同事们在BARseq技术的基础上又进了一步，使其可以刻画全基因组的基因表达情况[3]。然后，他们用第二代BARseq2技术检测了20种钙粘蛋白（cadherin）的表达。这种蛋白参与引导神经元投射的发育过程。他们发现，不管投射始于大脑的哪片区域，相似的投射都具有相似种类的钙粘蛋白的表达。“我们发现了两个皮层区域的相同特征，这说明我们找到了可以反映皮层普遍组织结构的东西，而不仅仅是某一特定皮层区域的特性或是数据伪迹。”Chen说。将BARseq2 应用于早期发育阶段能深入了解这些分子到底“是如何引导建立这些神经投射的”，他补充道。

如今，科学家们能借助新一代BARseq2技术着手解决一个长期困扰他们的问题：具有相同分子特征的一组神经元是否也具有相似的连接？换句话说，“我们是否可以通过神经元的基因表达模式，来预测其投射路径呢？”艾伦研究所主任曾红葵说。

带有条形码的病毒还有其他的用途。例如，哈佛大学医学院的神经免疫学家Francisco Quintana领导的研究团队开发了一种名为RABID-seq（狂犬病条形码相互作用检测后测序）的方法，以研究体内细胞间相互作用的机制[4]。研究人员设计了一种只感染特定细胞的病毒，病毒感染细胞后，会在胞内表达一个条形码。这可以帮助研究人员确定哪些细胞存在相互作用，然后确定介导这些相互作用的可能分子机制。他们还设计使病毒表达一种红色荧光蛋白mCherry，这样他们就能分离出受感染的细胞，并在后续实验中研究相关机制。Quintana说：“你可以一步到位，从‘哪些细胞相互作用’一直研究到‘作用机制’和潜在靶点。”

在艾伦研究所，曾红葵和她的同事们开发出了“增强子病毒”（enhancer viruses），用来在特定种类的细胞中促进目标基因的表达[5,6]。这些研究人员利用单细胞RNA测序和一种叫单细胞ATAC-seq的技术，寻找能让调控基因转录的蛋白进入的DNA片段。接着，他们可以在病毒中插入一些相关的调控序列，来促进特定种类细胞中特定基因的表达——这在大脑切片甚至是其他物种中，包括一些用传统遗传学手段很难处理的组织中都能实现，曾红葵说。

哥伦比亚大学的神经科学家Rui Costa打算利用这种增强子病毒，来分析响应多巴胺的神经元在小鼠的学习、奖赏和运动等行为中所起的作用，以及它们对退化的敏感性差异。在诸如帕金森病等神经疾病的患者体内，这种“多巴胺能”（dopaminergic）神经元会逐渐死亡。

光遗传技术

另外一些科学家正在借助光遗传技术——用光来控制细胞——来探测神经元活动。

通常，研究人员会用Cre重组酶来控制特定细胞中的基因开闭，或响应遗传或化学信号时开闭。2016年，两个研究组独立实现了用光控制Cre重组酶。这两个研究组都将Cre分成了两部分，只有在蓝光下重组后才会激活[7,8]。然而，这意味着一种组织里需要注入两段改造过的基因，并且它们还必须具有相仿的表达量，方能使该技术起效。“若能通过一个单链蛋白来控制Cre，那这种技术将会更加高效快捷。”Gaël Yvert说。他是法国里昂高等师范学校的一名分子遗传学家。

为了创建一个更高效的系统，Yvert的团队仔细研究了Cre的晶体结构，寻找这种酶的一些片段——也许某些片段就能用来实现光控Cre。他们想找到一些可以“操作一番就能用作开关”的东西，Yvert说。他们确定了几个对酶活性至关重要的螺旋（helices）结构，然后在这些位置上融合了一种取自燕麦植物的光响应结构域，最后创造出了LiCre：一个可以在几分钟内被激活，且强度远高于之前系统的酶[9]。

用BARseq2技术捕捉到的小鼠脑切片中的基因表达。来源：Yu-Chi Sun et al./Nature Neurosci.

Steven Wyler是德州大学西南医学中心的一名博士后研究员，他想用LiCre去研究神经节，以弄清从各个组织传来的信息是如何帮助大脑维持代谢稳态的。但是，神经节非常精细，极易受损。“LiCre有望帮助我们在不损伤神经节的前提下，定点定时地控制Cre的活性。”Wyler说。

研究人员还创造出一种传感器，可以测量活细胞内钙离子的动态变化情况。钙离子水平对一些生理决策至关重要——例如，它可以决定肌肉细胞何时收缩或何时启动程序性细胞死亡（凋亡）。因此，准确量化钙离子浓度有助于科学家建立细胞行为模型。阿姆斯特丹大学的细胞生物学家Joachim Goedhart说，目前大多数技术可以定性钙离子浓度的升降，“但要定量几乎不可能”。

这些现有的技术一般使用遇钙发荧光的蛋白质，但是荧光的强度也会受到实验条件的影响，如pH值、荧光蛋白的多少以及样品的厚度。绕过这些问题的一个办法是使用荧光寿命这一指标（荧光蛋白在激发状态下持续的时间）而非强度。

为了利用这一特性，Goedhart和他的同事改进了一种绿色荧光蛋白的结构，以优化其寿命和亮度，他们还添加了一个钙敏感结构域[10]。这样，这种新型荧光蛋白就能稳定地测量单细胞以及多细胞组织中的钙离子浓度。

阿姆斯特丹大学的神经科学家Helmut Kessels和他的同事们希望将这种荧光蛋白用于小鼠的脑切片中。他们想知道，随着细胞衰老或者伴随阿尔茨海默病症的出现，胞内钙离子浓度是否会下降。Kessels特别希望得到一个不受样本厚度影响的测量结果。他说：“由于钙离子浓度是通过荧光寿命成像来测量的，因此它应该是不受组织厚度影响的。”

显微镜的速度是这种荧光标记技术的一个潜在制约因素。目前，Goedhart的显微镜系统的测量速度上限是1.6秒一次，考虑到钙离子水平的波动与每秒约200次的神经元放电频率相关，这可能会限制荧光蛋白在神经科学领域的一些应用。但也有更快的显微镜：一些实验室已经搭建了自己的高速显微镜，而且如德国的徕卡公司（Leica Microsystems）和Picoquant公司也推出了自家的高速显微镜。

合并信号

实际上还有一个更宽泛的限制。10月刚在加州大学戴维斯分校设立实验室的神经科学家Christina Kim说，这些钙离子指示器只允许研究人员“实时读取神经活动”。Kim说，这是一个问题，因为你若想操纵神经元或深入研究其分子构成，你需要确定控制特定的行为的神经元有哪些。

在Kim还在斯坦福大学Alice Ting的化学生物学实验室工作时，她和博士后Mateo Sanchez开发了一种方法，可以弥补上述缺陷。

这种方法基于Ting实验室早期创建的一种技术，名为FLARE（快速光和活性调节表达）。同许多基因编码的传感器一样，FLARE结合了钙感应和光感应，以识别在特定时间窗口内活跃的神经元组。但它的先进之处在于：在检测到钙离子浓度升高以及蓝光信号时，它会驱使细胞膜中的一个蛋白进入细胞核中，启动荧光报告蛋白的表达[11]。这样，研究人员就获得了持续的荧光的记录，用于识别那些活跃细胞，随后还能对这些细胞进行其他的分析。

然而，Ting说FLARE有着“明显的荧光背景泄漏”——没有光和钙离子信号的时候也能观察到荧光信号。而且神经元至少需要经过十分钟的FLARE处理，这使FLARE远远无法用来追踪活体的一些快速行为，Ting说。

Kim和Sanchez做了两个关键的改进。首先，他们使用一种更高效的酶来控制转录因子的转移入核，以此来增强信号。其次，他们优化了光感应分子，以进一步减少荧光泄漏量。

这种改进后的技术被称为FLiCRE（快速光和钙调节表达），它可以在短短1分钟内标记被激活的神经元。在2020年12月发表的一篇论文中[12]，Kim和她的同事使用这种方法标记和识别了小鼠体内参与调节厌恶行为的细胞，如躲避电击或不愉快的气味。随后她们能只刺激相关的神经元，而无需制造实际的厌恶刺激。

更深的理解

诚然，钙离子浓度和其他的一些细胞性质可以向我们揭示神经环路的许多奥秘。但神经科学中一些最深奥的问题还需要其他方法来解决。Kaspar Podgorski说：“钙离子成像可以告诉你，在某一特定行为中哪个神经元被激活，但它无法告诉你神经元为什么被激活。”Podgorski是霍华德·休斯医学研究所，珍利亚农场研究园区（Howard Hughes Medical Institute’s Janelia Research Campus）的神经科学家。要想理解特定的神经元的激活机制，就需要测量该细胞的输入信号。

现在，一套传感器正帮助研究人员测量这些输入信号。例如，dLight1[13]和GRABDA[14]传感器可以检测多巴胺的变化。GACh系列传感器可以监测乙酰胆碱的传输，这是一种参与血管扩张和减慢心率的关键神经递质[15]。而红移多巴胺传感器（RdLight1）[16]可与基于绿色荧光蛋白的传感器联用，为科学家提供更精细的神经系统视图。

Podgorski说，神经元间的信息传递非常迷人。“神经元会收到成千上万的输入，如同信息轰炸一般。”细胞以某种方式有效地解析这些信号，并最终转化为一个个适当的动作。“神经计算（neural computation）主要涉及以下问题：信息是如何在神经网络中流动的？输入如何被转化为输出的？这些神经活动又去了哪里？”他说，“我想我们已经接近前沿，很快就能深入研究神经计算了。”

参考文献：

1. Kebschull, J. M. et al. Neuron 91, 975–987 (2016).

2. Chen, X. et al. Cell 179, 772–786 (2019).

3. Sun, Y.-C. et al. Nature Neurosci. 24, 873–885 (2021).

4. Clark, I. C. et al. Science 372, eabf1230 (2021).

5. Graybuck, L. T. et al. Neuron 109, 1449–1464 (2021).

6. Mich, J. K. et al. Cell Rep. 34, 108754 (2021).

7. Taslimi, A. et al. Nature Chem. Biol. 12, 425–430 (2016).

8. Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M. & Sato, M. Nature Chem. Biol.12, 1059–1064 (2016).

9. Duplus-Bottin, H. et al. eLife10, e61268 (2021).

10. van der Linden, F. H. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.06.21.449214 (2021).

11. Wang, W. et al. Nature Biotechnol. 35, 864–871 (2017).

12. Kim, C. K. et al. Cell183, 2003–2019 (2020).

13. Patriarchi, T. et al. Science360, eaat4422 (2018).

14. Sun, F. et al. Cell 174, 481–496 (2018).

15. Jing, M. et al. Nature Biotechnol. 36, 726–737 (2018).

16. Patriarchi, T. et al. Nature Methods17, 1147–1155 (2020).

原文以An expanding molecular toolbox untangles neural circuits为标题发表在2021年11月9日《自然》的技术特写上