王立铭·巡山报告 No.54：基因递送系统的新进展

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王立铭·巡山报告No.54:基因递送系统的新进展

王立铭 王王王立铭 2023-08-06 04:00 Posted on 美国

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你好，我是王立铭。2023年8月6日，第54期《巡山报告》又和你见面了。

本期报告的主题是基因递送系统。

所谓基因递送系统，指的是一套能将基因片段定向投送到特定器官、组织和细胞中的系统。对于很多疾病的预防和治疗来说，一套精确和高效的基因递送系统往往起到关键的作用。

如果一种疾病的发生是因为人体中某个重要基因出现了缺陷，例如很多单基因遗传病，那么如果利用基因递送系统将正常基因序列送入这些细胞，就有可能彻底治愈这些疾病。相反，也有不少疾病可能和某种基因的过度活跃相关，这个时候如果能利用基因递送系统将干扰该基因表达的工具送入细胞，例如CRISPR/cas9等基因编辑工具，也有可能起到釜底抽薪的效果。

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LNP和病毒载体

目前已经被深入开发和广泛利用的基因递送系统的种类繁多，但主流大概是这么两大类：基于脂质体纳米颗粒（LNP，lipid nanoparticles）的递送系统，和基于病毒的递送系统。下面我们将会简单介绍下两套系统。

我们先说基于LNP的递送系统。这套系统在新冠大流行之后变得广为人知，因为大流行中使用最为广泛的几款mRNA疫苗使用的都是这套递送系统。其工作原理简单来说就是，将编码新冠病毒刺突蛋白的RNA片段包裹在空心的脂质体纳米颗粒中，再注射入人体，这些纳米颗粒就可以和人体细胞融合，将RNA片段送入人体细胞并生产刺突蛋白，从而激发人体对新冠病毒的免疫记忆。

可想而知，这套基因递送系统的用途当然不仅仅是新冠，目前已经有多家公司利用这一技术路线开发针对其他病原体的疫苗，例如流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、带状疱疹病毒（VZV）、巨细胞病毒（CMV）等。不少产品已经进入了临床试验阶段[1]。

除了开发疫苗，基于LNP的基因递送系统还有更广泛的想象空间。例如Moderna公司也试图用LNP递送系统将编码细胞因子白介素12（IL-12, interleukin-12）的RNA片段投送到肿瘤组织内部，让肿瘤细胞生产和分泌IL-12，刺激肿瘤微环境中的免疫反应，起到杀伤肿瘤的作用[2]。2021年，Intellia公司也使用LNP递送系统，治疗一种先天单基因遗传病，转甲状腺素蛋白淀粉样变性。他们将靶向人体TTR基因的CRISPR/cas9基因编辑工具投送到患者肝脏中，破坏其体内过度活跃的TTR基因表达，且观察到了显著且持续的临床效果[3]。

 

我们再说说基于病毒的基因递送系统。这其实是一个很古老的思路，人们很早就意识到病毒在感染宿主细胞的时候会将病毒内部的遗传物质送入宿主细胞中，这些来自病毒的基因片段会在宿主细胞内启动蛋白质生产并参与新一代病毒颗粒的组装。

 

以我们都非常熟悉的新冠病毒为例，在它感染宿主细胞后，新冠病毒内部包裹的一条由大约3万个碱基组成的单链RNA分子也会随之进入细胞，这条单链RNA分子编码了多种蛋白质，其中既有新冠病毒的重要结构单元例如病毒表面的刺突蛋白，也有参与新冠病毒复制的重要蛋白，例如RNA聚合酶。那么既然如此，如果对天然的病毒加以改造，将人们希望递送的基因片段放进病毒基因组序列之中，自然就可以实现特定基因的定向投送。

 

早在人类第一次尝试基因治疗——也就是将特定基因片段送入因基因缺陷而导致的疾病患者体内时，使用的就是经过改造的病毒载体。在1990年代，研究者们使用逆转录病毒（Retrovirus）将完整的腺苷脱氨酶基因（ADA，adenosine deaminase）导入患者的免疫细胞中，用于挽救患者免疫细胞的功能，治疗先天性的重症联合免疫缺陷症（SCID）[4]。最早接受这种治疗的一位患者在10年回访中仍然有多达20%的淋巴细胞在持续表达ADA基因，并且得以维持基本健康的生活[5]

 

一直到今天，人们仍然在广泛的使用各种病毒递送系统用于治疗疾病。目前欧美市场上获批的基因治疗产品，绝大多数都是基于病毒载体的。例如Bluebird Bio公司的产品Zynteglo，利用慢病毒（Lentivirus）载体治疗地中海贫血症；诺华公司的Zolgensma，利用腺相关病毒（AAV，adeno-assciated virus）治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）；PTC Therapeutics公司的Upstaza，利用AAV载体治疗芳香族 L-氨基酸脱羧酶缺乏症(AADC)；等等。目前还在临床开发中的其他类别的病毒载体也有不少。例如Krystal Therapeutics公司利用单纯疱疹病毒载体（HSV-1），将7型胶原蛋白基因投送到患者皮肤组织中，治疗因该基因缺陷导致的隐性营养不良性大疱性表皮松解症（RDEB），在临床试验中取得了很不错的疗效[6]

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基因递送系统的靶向性问题

那么这些基因递送系统有没有什么潜在的技术问题呢？

 

当然有，这些运载工具本身的毒副作用就是非常值得重视的问题。LNP载体往往有较强的免疫原性，例如新冠mRNA疫苗注射后往会引起很大比例的发烧、疲劳、注射部位疼痛等副作用。病毒载体也有可能激发强烈的免疫反应。例如1999年，一位年轻患者在接受基于腺病毒载体的基因治疗后引发强烈免疫反应并死亡，对整个基因治疗领域都产生了深远影响[7]。另外，一部分病毒载体（例如逆转录病毒和慢病毒）在感染人体细胞后，会将自身基因片段插入宿主细胞的基因组DNA上，存在一定破坏宿主基因组结构完整性的风险。

 

而更为关键的是，在临床开发中，LNP也好，病毒载体也好，用来做基因递送都面临一个相同的技术难题：如何提高基因递送的靶向性。就是如何保证能把特定的基因片段投送到特定组织和器官、特定的细胞类型中，尽量避免对其他无关组织、器官和细胞类型的干扰。

 

LNP的构成是各种脂类分子（包括可电离脂质、胆固醇、磷脂和聚乙二醇化脂质分子等）。在血液中LNP很容易和专门结合脂类分子的载脂蛋白（ApoE, apolipoprotein E）结合，并被运载到肝脏。这也是为什么大多数LNP药物会倾向于在肝脏中富集。

 

想要改变这种倾向性，一个思路是改变LNP的脂类分子构成。例如2020年有研究发现，在LNP中添加某些带有正/负电荷的脂类分子，可以改变LNP表面的电化学特性，实现对肺部、脾脏、肝脏、肌肉等器官的一定程度的倾向性[8] [9]。另一个技术思路则是，在LNP上插入本身就具备细胞靶向性的分子标记，为LNP赋予更精确的投送能力。例如在LNP表面连接上专门识别CD4蛋白的抗体，就能将LNP定点投送到T细胞附近，因为这些T细胞表面存在大量的CD4蛋白[10]。2023年1月发表的一项研究中，也有研究者们筛选得到了一个能够专一结合视网膜感光细胞的肽段，将其插入LNP表面，就能实现LNP对视网膜感光细胞的靶向性投送[11]。

 

而针对病毒的改造方式就更为丰富。作为天生的入侵者，病毒感染宿主细胞的过程，本身就具备一定的特异性：简单来说就是特定病毒往往只能感染特定生物的特定细胞类型。

 

例如我们非常熟悉的人类免疫缺陷病毒（HIV），就能够专一感染人体特定种类的淋巴细胞。这是因为HIV入侵宿主细胞需要借助这些淋巴细胞表面的两个特征性蛋白质，CD4和CCR5[12]。事实上一种治疗艾滋病的思路就是利用基因编辑手段破坏人体免疫细胞的CCR5基因，从而阻止HIV的感染[13]。类似的，新冠病毒感染人体细胞的过程，也依赖于新冠病毒表面的刺突蛋白与人体细胞表面的ACE2蛋白的结合[14]。

 

既然病毒天然就具备细胞类型的精确靶向性，那么我们自然可以想到，通过挑选合适的病毒，或者对已有的病毒载体进行改造，就有可能让它们精确靶向某一类我们所期待的细胞类型。

 

这方面进展最多的，可能是对AAV病毒载体的改造。AAV因其较低的免疫原性和成熟的生产工艺，被普遍看作是最有前途的基因递送系统之一。天然存在的AAV载体因血清型不同已经体现出了一定程度（但很有限）的器官选择性，例如AAV1对肌肉组织、AAV8对肝脏、AAV9对肝脏、肺、和大脑组织等。但很多研究者预计，如果对AAV病毒的衣壳特征进行改造和筛选，有可能实现更精确的靶向性。例如，通过对AAV表面蛋白质序列进行定向进化和筛选，研究者们发现了能够定向感染中枢神经系统和周围神经系统的新病毒载体[15][16]。利用类似思路，研究者们也开发出了能够感染大脑中一群特定的免疫细胞——小胶质细胞——的AAV载体[17]。在其他组织类型中，例如肌肉细胞[18]、内耳细胞[19]、T淋巴细胞[20]等等，近年来也有非常不错的研究进展。

 

上述进展主要依赖于对病毒进行大规模的随机突变和反复筛选。而最近也有一项研究通过对病毒载体进行定向改造实现了对肌肉细胞的定向投送[21]，展示了一种全新的改造病毒载体的思路。

 

简而言之，这项研究利用了肌肉细胞一个天然属性：骨骼肌细胞在发育过程中是独立的细胞，但在发育完成后会彼此融合形成粗大的肌纤维。这种细胞融合的过程依赖于肌肉细胞表面的特定融合蛋白，如Myomaker和Myomerger。一个有趣的联想是，肌肉细胞之间的融合，和有包膜病毒对宿主细胞的入侵，两个迥然不同的生物学过程却都涉及到细胞膜的融合过程。研究者们因此想到，如果把这些肌肉细胞融合蛋白插入有包膜病毒的表面，也能够促进病毒载体和肌肉细胞的融合，实现对肌肉细胞的靶向投送。他们根据这个思路对慢病毒进行了改造，果然实现了对肌肉组织的高效识别和投送。

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蛋白质递送系统

我们刚刚描述的基因递送系统，主要的运输对象是DNA/RNA这些核酸分子，这些核酸分子进入目的细胞后再生产对应的蛋白质。需要注意的是，直接将蛋白质分子投送到特定细胞内，往往也能实现类似的目的。

 

近年来，也已经有一些蛋白质投送工具被开发出来。一个特别值得注意的方向仍然是利用病毒载体。这个技术路线的逻辑很简单，将需要投送的蛋白质分子直接连接在病毒颗粒中某个蛋白质分子的末端即可。例如在2022年，哈佛大学David Liu实验室将单碱基基因编辑工具蛋白通过一个肽段连接在逆转录病毒MMLV颗粒中，当类病毒颗粒进入宿主细胞后，碱基编辑工具被释放出来，可以对宿主细胞的特定基因进行编辑[22]。

 

在2023年3月，布罗德研究所张锋实验室开发了一套全新的蛋白质递送系统，这套系统具备了精确靶向性的巨大潜力[23]。这套全新递送系统的学习对象不是病毒，而是细菌。更精确的说，是很多细菌中存在的可收缩注射系统（eCIS，extracellular contractile injection system）。

 

我们可以吧细菌的eCIS系统看成是一套细菌生产和释放的微型注射器，其外形是大约100纳米长、可收缩的针管状结构。细菌在入侵和感染宿主的时候，可以批量释放这些微型注射器，它们可以结合在宿主细胞膜上，刺破细胞膜，将针管内部的蛋白质注射到细胞内部，干扰细胞的生存和活动，为细菌入侵和繁殖提供帮助[24]。

 

张锋实验室就试图改造和利用这套天然存在的蛋白质投送系统。他们将发光杆菌中负责制造eCIS的完整基因序列（包含16个基因，pvc1-16）导入大肠杆菌中，从而批量生产和组装出这种微型注射器。当然，想要这套系统发挥作用，真正重要的是是否能对它进行两个方面的改造：是否可以随意替换eCIS的投送蛋白，以及是否可以改造eCIS以实现对特定细胞类型的投送。

 

首先研究者们证明，这种微型注射器具体注射什么蛋白质进入细胞，确实是可以人为改造的。只需要eCIS基因序列上编码被投送蛋白的相应片段，更换为需要被投送的蛋白质基因序列即可，例如基因编辑工具cas9，绿色荧光蛋白GFP，重组蛋白Cre等等。

 

其次，研究者们发现eCIS的其中一个组成部分，pvc13蛋白，可能和微型注射器对宿主的识别相关。这个蛋白位于微型注射器的针头位置附近，直接和宿主细胞表面相接触。因此，如果改造pvc13蛋白的构造，让它能结合特定细胞类型的表面蛋白质，也许就可以实现eCIS的细胞靶向性。例如，如果在pvc13蛋白上接上一个能够结合人体细胞表面EGFR蛋白的肽段，改造后的微型注射器就可以结合人体细胞，并将注射器内部的蛋白质注射进入人体细胞内部。

 

在上述两层改造完成后，细菌天然存在的eCIS系统就被升级成了一套能够定向向特定细胞注射特定蛋白质分子的基因递送系统。研究者们还进一步证明了这套系统还能在小鼠体内（包括大脑中）发挥功能。

 

相比投送DNA/RNA基因片段，直接投送蛋白质分子的一个潜在好处是，蛋白质分子进入细胞后往往会被快速降解，在细胞内存在和发挥功能的时间有限，可能可以避免对细胞功能长时间的干扰和破坏。因此我们可以想象，在不同的应用场景下，DNA/RNA递送系统和蛋白质递送系统可能会体现不同的独特价值。

 

在这里请允许我稍作总结：很多人类疾病都和特定基因的缺陷或过度活跃直接相关，因此如果能利用基因递送系统，直接操纵这些基因的开关，将能够帮助我们直接干预和治疗这些疾病。而因为这些致病基因的活动几乎总是具有时空特异性——也就是只在特定时间、特定细胞类型中发挥作用，因此基因递送系统也相应的需要具备操控的时空精确性。

不管是基于LNP、基于病毒载体、还是基于eCIS的基因递送系统，在这些方面都还大有潜力可挖，大有机会可以抓住。

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 参考资料

[1]https://www.modernatx.com/research/product-pipeline

[2]https://aacrjournals.org/clincancerres/article/26/23/6284/83111/Intratumoral-IL12-mRNA-Therapy-Promotes-TH1

[3]https://www.nejm.org/doi/10.1056/NEJMoa2107454?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed

[4]https://www.science.org/doi/10.1126/science.256.5058.808

[5]https://ashpublications.org/blood/article/101/7/2563/106703/Persistence-and-expression-of-the-adenosine

[6]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35347281/

[7]https://www.sciencehistory.org/distillations/the-death-of-jesse-gelsinger-20-years-later 

[8]https://www.nature.com/articles/s41565-020-0669-6

[9]https://www.nature.com/articles/s41467-020-17029-3

[10]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34091054/

[11]https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.add4623

[12]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19339947/

[13]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31509667/

[14]https://www.nature.com/articles/s41586-020-2012-7

[15]https://www.nature.com/articles/s41593-021-00969-4

[16]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35643078/

[17]https://www.nature.com/articles/s41592-022-01547-7

[18]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34506722/

[19]https://www.nature.com/articles/s41467-019-11687-8

[20]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36638795/

[21]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37075755/

[22]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35021064/

[23]https://www.nature.com/articles/s41586-023-05870-7

[24]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30905475/